内容提要 目的:研究地黄寡糖在小鼠及大鼠体内的吸收和吸收部位。方法:用高效液相色谱/柱后荧光衍生化法测定小鼠口服和静脉注射水苏糖后的血药浓度;大鼠原位肠灌流模型研究水苏糖的吸收和吸收部位;肠抑菌实验观察水苏糖在肠产内的代谢。结果:口服吸收快但少,生物利用度为3.82%。在胃、十二指肠、空肠和回肠的吸收率分别为6.03%、13.80%、8.33%和0.53%,在大肠内不吸收。正常组及卡那霉素抑菌组的小鼠灌服水苏糖3h后,两组肠内的水苏糖残存量分别为8.6%和93.4%。结论:水苏糖口服吸收少,主要吸收部位在小肠上部,未吸收的水苏糖在肠内被细菌破坏。
关键词:地黄寡糖 水苏糖 吸收 肠内细菌
地黄寡糖由本所植化室从生地黄中提取,其中含有效成分为四糖60%,三糖20%,其余20%为双糖或单糖。药理实验证明,该混合物具有增强机体造血功能和调节免疫功能等活性,其中主要有效成分为四聚糖水苏糖。曾有文献认为,水苏糖等一些寡糖在胃肠道不吸收而经肠道细菌代谢为CO2、H2、短链脂肪酸等,因此,无人研究其活性。我所在研究地黄多糖的基础上,分离得到了地黄寡糖并证实了其良好的生物活性。但是地黄寡糖在胃肠道中是否吸收,如何吸收均属未知。本研究通过考察其吸收动力学的特点,为开发应用该活性成分提供依据。经药理实验证明水苏糖与地黄寡糖的生物活性无明显差异。因此,本实验以水苏糖为研究对象。
材料与方法
1、动物 昆明雄性小鼠,体重18-22g;Wistar雄性大鼠,体重300~340g均由本院动物中心提供。
2、药品与试剂 水苏糖为Sigma公司产品,高碘酸钠为普通化学试剂,牛磺酸为生化试剂。
3、主要仪器 P1000色谱泵(美国光谱物理),LC-5A色谱泵,RF-530荧光检测器,C-R3A积分仪(日本岛津),DDB-300多通道电子蠕动泵,WC/09-05恒温水浴,95%O2-5%CO2混合气(北京氦普北分气体工业有限公司)。
4、实验方法
4.1大鼠原位肠灌流 参照文献的方法,大鼠用1%戊巴比妥钠(0.5/100g,ip)麻醉,仰卧位固定,腹部作U形切口暴露腹部器官。先结扎幽门静脉、腹腔动脉、肝动脉和左肾动脉,用0.5mm×1mm的塑料管从右肾动脉插管,管尖穿过腹主动脉进入上肠系膜动脉5mm,作为灌流液入口(灌流液组成为:Krebs-Ringer NaHCO3缓冲液,含0.3%牛血清白蛋白,0.5%右旋糖酐T-40,PH7.4),固定后立即开通灌流,流速3.0ml/min。在门静脉上离肝脏约1.2cm处作一切口,用1.2mm×2mm的塑料管面向小肠插管并固定,切开隔膜,让流出物导管与门静脉形成一条直线,下腔静脉在肝和心脏间结扎,并将流速提高到8.0ml/min.用加热灯泡维持标本温度在(36±2)0C。胃下方十二批肠和盲肠处分别用线结扎。用灌流液50ml对标本循环15min后,将水苏糖10mg注入十二指肠,分别于0、5、10、15、20、60、90、120min测定灌流液中的水苏糖浓度。
4.2吸收动力学 小鼠灌胃前12h禁食,自由饮水。按2g/kg灌胃后于0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0h采血,离心(3000r/min,10min)分离的血浆样品供测定用。用于静脉注射小鼠自由进食和饮水。按200mg/kg尾静脉注射后于0、5、10、15、30、60、120、240min采血,分离血浆供测定用。
4.3吸收部位实验 大鼠用1%戊巴比妥钠(0.5/100g,ip)麻醉,仰卧位固定,腹部切口,分别暴露胃、十二指肠、空肠、回肠和直肠。用370C的生理盐水(PH2用于胃、PH6.5用于十二指肠和空肠、PH7.4用于回肠和直肠)清洗内容物后在所需部位的两端插管,并用止血钳夹紧。将水苏糖(50mg/kg)注入胃或不同部位的肠腔内后,1h后用生理盐水冲洗各部位,测定其在各部位的残留量,推算吸收率。
4.4肠细菌代谢实验 小鼠随机分为正常组和卡那霉素处理组,每组3只。卡那霉素处理组为连续3天灌服卡那霉素1g/kg,每日两次。第4天两组分别灌服水苏糖(50mg/kg),3h后取全肠,匀浆后测定水苏糖的含量。
4.5样品测定 参照文献方法,取血浆100ul于离心管中,加1mol/L高氯酸60ul,离心(10000r/min,2min)后取上清液,加入1mol/L NaOH 40ul,100ul用于色谱分析,其他样品可过滤后直接进样。
4.6药代动力学参数的处理 血药浓度数据采用统计矩的方法处理得到如下参数:达峰时间(Tmax),达峰浓度(Cmax),生物半衰期(t1/2),平均滞留时间(MRT),曲线下面积(AUC),总清除率(CLtol),表观分布容积(Vd)和吸收率(F)。AUC根据梯形法计算。
结 果
1、水苏糖的吸收情况 见图1。水苏糖在给药后1h内以一定的速度吸收,以后呈缓慢吸收趋势,2h时吸收已达平衡,吸收率约为10%。
2、小鼠静脉注射和灌胃后的血药浓度随时间变化情况 见图2,动力学参数见表1。静脉注射后,水苏糖糖的动力学呈现出与一般药物相似的特点,即含快速和慢速两个消除相。口服灌胃后,水苏糖吸收较快,15min在血中即可测到其浓度,但吸收不规则。由AUC求得的吸收率为3.75%。水苏糖在体内消除较快,半衰期约为40min。
3、水苏糖在胃肠道的吸收情况 见图3。水苏糖在胃、十二指肠、空肠和回肠的吸收率分别为6.03%、13.80%、8.33%和0.53%,在大肠内不吸收。
4、肠道菌对水苏糖吸收与代谢的影响 分别给正常组及卡那霉素处理组的小鼠灌服水苏糖的实验结果表明,给药3h后,正常组肠内的水苏糖残存量为8.6%,而卡那霉素处理组肠内的水苏糖残存量却高达93.4%,见图4,提示水苏糖在肠内可大量被细菌代谢.
表1 水苏糖在小鼠体内的动力学参数
Cmax Tmax t1/2 MRT AUC0 Vd CLmt F
(mg/l) (h) [mg/(l·h)]] (L/kg) [L/(h·kg)] (%)
口服
39.9 2.0 0.57 1.78 9.00 0.02 0.01 3.82
(2g/kg )
静脉注射
_ _ 0.62 0.62 240 0.52 0.82 _
(200mg/kg)
注:*换算成同等剂量的AUC
讨 论
原位大鼠肠灌流及整体动物实验证明,水苏糖可经胃肠道吸收,但吸收少。这如何与其良好的生物活性相联系呢?从目前的结果可以作如下推测:是否在肠道局部刺激淋巴组织而发挥其免疫作用?已有研究表明,局部刺激淋巴组织能增加淋巴细胞的移动,促进GM-CSF和IL-1样活性物质的分泌。水苏糖在连续给药时可能通过不断刺激淋巴组织而产生免疫效果。以上推测有待药理实验证明。
肠道细菌对糖的吸收有一定影响,这在Ahr等对阿卡波糖的研究中已得到证实。本实验也间接证明抑菌可提高水苏糖的吸收。Ahr等的研究还表明,连续给药可减少肠道细菌而增加阿卡波糖的吸收。因此可以推测,在连续给药进行水苏糖的药理活性研究时,其吸收会略有增加。
本研究中还发现水苏糖在胃肠道中可能会降解为三聚糖而被吸收,有关这方面的研究工作正在进行。